单孢培养即纯种的建立，也称纯化培养。无论是野外或田间采集的土壤，还是诱导培养后，获得的大量AMF孢子都是不同的属种混合在一起，必须将形态上不同的孢子分别挑出来接种到宿主植物上进行纯化培养，即可收集到足量的、纯净的AMF菌种资源。
单孢培养是从小心仔细地选择孢子开始的。孢子可以从田间得到，只要是健康并能侵染的都可以，但成功的可能性由于土壤类型、有机质含量和环境状况或季节有很大的差异。
步骤：
1. 接种前3-4 d用湿筛法从诱导培养的土壤中提取孢子。将形态各异的孢子放到装有灭菌蒸馏水的不同表面皿中区分摆放，放入4 °C冰箱保存，每天清洗（持续3-4 d）并去除失活和破损孢子，保留洁净、新鲜、光亮、饱满的孢子备用。
2. 按质量控制要求准备高粱种子（参见“质量控制”部分）、灭菌的沸砂基质、50穴苗盘、塑料花盆和洁净的水，备用。
3. 50穴苗盘装入灭菌的沸砂基质至每穴2/3处，用洁净的水浇透。使用装有200 µl枪头的移液器（量程20-200 µl）在体视镜下吸取孢子，直接滴放在装好并浇水的基质上，每穴放1个孢子，再加盖1-2 cm灭菌沸砂基质于孢子上，补适量洁净的水，播种催芽的高梁种子2-3粒，覆盖0.5-1 cm灭菌的沸砂基质。
4. 放置光照培养室培养（培养条件参见“质量控制”部分）。6-7周后将单孢培养苗盘中的高梁苗与培养物一起取出，放在已消毒的塑料盘中，用火焰灭菌的壁纸刀将培养物纵向切取整体的1/4，进行湿筛。在体视显微镜下检查菌丝量及孢子繁殖情况，无侵染或无孢子的丢弃。
5. 有孢子或有较多菌丝的样品继续培养。将消毒的塑料花盆中装入灭菌的沸砂基质至1/3处，上述检查后确定已有孢子的剩余3/4培养物与高梁苗，直立于1加仑塑料花盆的中心位置，周围添加灭菌的沸砂基质到花盆3/4处，用洁净的水浇透，播种催芽的高梁种子30-50粒/盆，覆盖0.5-1 cm灭菌基质，浇少量洁净的水。
6. 放置光照培养室培养至少3个月，培养条件参见“质量控制”部分。在植物缺水时适量浇洁净的水，在植物显示缺肥时补浇适量20%的霍格兰营养液。
