野外调查及样品采集
准备需要的采样工具 (一次性无菌PE手套、小铁锹、消毒湿纸巾、剪刀和枝剪、塑料自封袋、标签纸、铅笔、记号笔、布袋、照相机、采样记录本、GPS等)，根据采样目的选择调查地点、样点和长势良好的寄主植物，记录调查地点的行政区划名称、地理坐标、地形、植被、土壤类型、土壤质地、寄主植物名称及生长状况等，并对生境拍照。 去除地表枯枝落叶、大块砂石和其他杂物，用小铁锹 (消毒湿纸巾擦拭干净) 沿寄主植物周围垂直向下...
华东地区AMF菌种保藏与研发中心
East China AMF Strain Collection and R&D Center
研究方法
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诱导培养
诱导培养通常是为获得单一菌种资源的必要条件。野外直接收集的孢子可能存在如下问题：1) 看似健康，但实际没有活力。2) 由于根的色素、土壤理化性质及土壤微生物的影响而失去或改变其原有结构特征。3) 直接采集的土壤样品中仅仅是那些有足够活性和生物量并结孢子的种，而诱导培养会产生不同的结果。为避免资源的遗漏和减少鉴定工作的误差，样品采集后，应在温室内利用原始土壤作为培养基质进行诱导培养，以获得健康的孢子作为...
单孢培养
单孢培养即纯种的建立，也称纯化培养。无论是野外或田间采集的土壤，还是诱导培养后，获得的大量AMF孢子都是不同的属种混合在一起，必须将形态上不同的孢子分别挑出来接种到宿主植物上进行纯化培养，即可收集到足量的、纯净的AMF菌种资源。 单孢培养是从小心仔细地选择孢子开始的。孢子可以从田间得到，只要是健康并能侵染的都可以，但成功的可能性由于土壤类型、有机质含量和环境状况或季节有很大的差异。步骤：1. 接种前3-4 ...
菌剂扩繁培养
扩繁培养包括单孢扩繁培养和菌剂扩繁培养，是为了获得足够量的纯化菌种而进行的盆栽培养。可用单孢培养物（含有孢子、侵染的根段或菌丝），也可以用纯化菌种的培养物。步骤：1. 在称样区内，称取待扩繁菌种样品50-100 g备用，或在体视镜下挑取待扩繁菌种的孢子50-200个备用。2. 按质量控制要求准备高粱种子（参见“质量控制”部分）、灭菌的沸砂基质、1加仑塑料花盆和洁净的水，备用。3. 塑料花盆中装入灭菌的沸砂基质至2/3处...
收获与重种
诱导培养（或扩繁培养）在光照培养室培养至少3个月以后，准备收获。1. 先将花盆置于温度湿度相对稳定的房间内干燥（根据所在地区相应调整，北方城市和南方城市的冬天可以直接在无光照的室内自然晾干，南方城市在空气湿度较高的季节建议用空调及除湿机等调整空气温湿度，保证约1-2周时间内培养物干燥），然后收获所有盆中培养物（包括植物根系、菌丝、孢子和基质）。2. 操作人员双手洗净并用吸水纸擦干后，带一次性PE手套将桌面...
菌种储存
装袋准备保藏的培养物按属种顺序放置于冷藏室或4 °C冰箱中保存。AMF通常保藏盆栽的“全培养物”，即剪去植株地上部分后培养容器中的所有基质、根系、孢子和菌丝。由于根系在长期保存过程中，容易霉变，滋生其他微生物，可以选择去除不保藏。最好使用4 °C种子柜保存培养物，如果条件不具备也可使用风冷冰箱或冷藏室（空调控温16-18 °C）保存
质量控制
由于AMF菌种资源收集与保藏的各个步骤 (包括：诱导培养、单孢培养、扩繁培养、取样、检查、收获等) 都是在开放或半开放的有菌环境下进行，并且培养时间较长 (一般3个月以上)，因此，必须尽量保持操作和培养空间洁净，寄主植物健康，尽可能降低植物病原物、腐生生物和昆虫等的滋生、有毒或有害物质的污染等。1. 寄主的选择与种子消毒：一般选用对AMF依赖性较大、对菌种专一性较小、根系较发达，适合温室盆栽的植物。已经成功运用...
孢子提取与清洗
方法：土壤或盆栽培养物中AMF孢子的分离提取采用湿筛倾析法。工具：土壤标准筛（孔径为上层0.8 mm，中层0.25 mm，下层0.055 mm）、搅拌器。流程：称取菌剂或土壤放入搅拌机烧杯中→加水至杯1/3→高速搅拌10~15 s →悬液依次通过3个土壤标准筛→反复冲洗菌剂或土壤直到悬液清澈（大部分粗沙砾残余物留在烧杯中）→流水冲洗每层筛子直至流出清水→用洗瓶将筛中的残余物轻轻冲洗汇集到筛子的一边→倒入培养皿中→体式显微镜下观察...
清洁孢子的分离
在体视显微镜下，将湿筛分离出的外表健康的孢子人工转移至表面皿中的自来水里，小心、仔细地检查，除去所有的菌丝和碎屑，表面皿置于培养皿中以减少蒸发，或放在有盖的瓶中并于4℃下至少存放48 h。然后再小心地重新检查，挑出并丢弃任何看上去不正常的孢子，如：变色、有斑、内含物异常、过度透明或在孢子表面有细菌或真菌生长等。换水后，再将孢子贮于4℃下24~48 h再观察，去掉不典型的孢子，然后水洗留在表面皿或转移至放有灭...
形态鉴定方法
制片：获得同种的洁净孢子、孢子果和根段（如有）后，平均分为4份，分别以乳酸、乳酸+Melzer’s试剂、PVLG、PVLG+Melzer’s试剂为浮载剂制作装片。取出载玻片并确保干净（南方潮湿环境容易长杂菌）；在载玻片一端粘贴或书写标签（包括菌种编号，浮载剂类型及制片日期）；在体式镜下，将其中一份孢子尽量聚拢，用移液枪或吸管吸取孢子置于玻片上（尽量减少水的吸取），玻片自然晾干直至孢子周围的水几乎变干时，滴加相应的浮载剂...
分子生物学鉴定方法
DNA提取：1. 从纯化的培养物筛取孢子，挑出有活力的孢子，用灭菌的蒸馏水洗净；2. 将3-20个孢子用移液器转移到1.5 mL的灭菌离心管底部，使水尽量少，将装有孢子的离心管置于冰上；3. 将水浴锅开到94℃，将Taq聚合酶配套的buffer解冻后置于冰上；4. 用枪头将孢子捣碎，使其内容物释放出来。该过程也要在体视镜下进行，以便能看到孢子和确保内容物（包含DNA）释放出来。因为孢子周围液体很少，因此不会有太多滑动。5. 将枪头在离...
根系侵染率测定方法
不同物种条件不同，需要优化，下面以濒危植物夏蜡梅为例。根据Phillips和Hayman（1970）提出的台盼蓝（曲利苯蓝）的染色方法来测定夏蜡梅菌根侵染率，主要包括透明、漂白、酸化、染色和脱色等步骤。1、 根样采集从植物根部选择颜色相对较浅，最细一级的根（多条根相加总长不少于40 cm）放入FAA固定液固定24 h以上备用，或冷冻保存备用。注：根样的采集应具有代表性，如果是从多个植物根系收集，应分别每株取样后再进行混合取样...