华东地区AMF菌种保藏与研发中心
East China AMF Strain Collection and R&D Center

根系侵染率测定方法

不同物种条件不同,需要优化,下面以濒危植物夏蜡梅为例。

根据Phillips和Hayman(1970)提出的台盼蓝(曲利苯蓝)的染色方法来测定夏蜡梅菌根侵染率,主要包括透明、漂白、酸化、染色和脱色等步骤。

1、 根样采集

从植物根部选择颜色相对较浅,最细一级的根(多条根相加总长不少于40 cm)放入FAA固定液固定24 h以上备用,或冷冻保存备用。

注:根样的采集应具有代表性,如果是从多个植物根系收集,应分别每株取样后再进行混合取样;如果是单株植物,应分别从不同部位取样后再混合取样,如果取样后直接做实验的话可以不用固定。取根系时为了减少对根外菌丝的破坏,动作尽量轻柔,根系允许带一些泥土。

2、 透明

将根从FAA固定液中取出,蒸馏水浸洗数次后剪成1cm长根段,放入50ml离心管中,加入20%的KOH溶液、拧好盖子放入装有水的烧杯(500 ml或250 ml),将烧杯置于90 ℃水浴锅水浴3 h。

注:其目的在于除去根部皮层细胞中的细胞质,便于以后染色处理时染料的尽快渗透。

3、 清洗

将离心管取出,倒去KOH,用清水轻轻漂洗根样数次,但勿用力搅动,以防根样表面的根外菌丝脱落,当水不再呈黄色时即可。

4、 漂白

向装有清洗好的根的离心管中加入碱性H2O2浸泡,在室温条件下放置1 h(人工种植的根系40min),当根系的颜色由棕色变白即可。

5、 再清洗

轻轻倒去离心管中的碱性H2O2溶液,用清水漂洗几次。

6、 酸化

向装有清洗好的根的离心管中加入2%的HCl,室温酸化4 min。

注:酸化时间过长根会变烂。

7、 染色

轻轻倒出HCl,加入0.05%的台盼蓝乳酚染液,再放回水浴锅90 ℃水浴30 min。

注:回收染色液可重复再利用,但是效果有待进一步确认。

8、 脱色

取出上述已染色的根段,蒸馏水换洗数次后,用乳酚试剂脱色,常温脱色2 h - 3 h直到根样中多余的染料大部分被清除为止。

9、 制片

将根段置于涂有封固剂的载玻片上进行制片,一张载破片上可放2~3条根,盖上洁净的盖玻片,加压使根破碎,并除去其中气泡。记录玻片编号及制片时间。


   10、观察

观察制作好的载玻片于200倍生物显微镜下观察菌根侵染情况。


药品配制:

1、 FAA固定液配制(可多配一点)

50% 酒精90 ml、冰醋酸5 ml、37%甲醛5 ml、加入5 ml甘油防止挥发

2、 20% KOH溶液配制(可多配一点)

20 g溶于100ml蒸馏水中

3、 碱性H2O2

2ml 30%的H2O2 + 0.3 ml氨水,加水至55ml

注:随配随用,不能放置过久

4、 2% HCl溶液配制(可多配一点)

10 ml 分析纯盐酸(36%)加入175ml蒸馏水中

5、 乳酚试剂:

苯酚:乳酸:甘油:蒸馏水=1:1:2:1(v/v)

6、 0.05% 台盼蓝乳酚染液

0.5 g台盼蓝加入1000 ml乳酚试剂中

7、 浮载剂(PVLG)

聚乙烯醇1.66 g + 甘油1 ml + 乳酸10 ml + 蒸馏水10 ml

注:聚乙烯醇很难溶解,可以将溶液置于90 ℃水浴锅水浴溶解。

   酸性酒精:5%醋酸  90%酒精 5%双氧水(脱色可选择用酸性酒精)